木瓜蛋白酶的开发与应用

本文总结了近年来我校木瓜蛋白酶的研究及应用进展.1)对国产木瓜乳汁粗酶进行了分离与纯化,得到了重结晶的木瓜蛋白酶和木瓜凝乳酶,结晶分别为柱状和针状;2)为了提高木瓜蛋白酶活性检测的准确性,增强国际市场的竞争能力,采用紫外分光光度法,茚三酮显色法及BAEE法对国内外不同来源的木瓜蛋白酶进行了比较,找出以上3种方法的最适反应条件、提出了在工农业生产中的应用途径;3) 在研制木瓜蛋白酶的基础上,利用酶工程方法,制备了纤维素固定化木瓜蛋白酶和琼脂固定化木瓜蛋白酶,增强了酶的热稳定性及保存性,用于啤酒生产可以提高防浊效果、增进氨基酸营养;4)与广州园艺公司、广州酶制剂厂及前进食品厂等合作,进行了木瓜蛋白酶的系列产品开发,陆续研制出国产嫩肉粉、啤酒澄清剂、饼干松化剂、饲料添加剂等新产品,在食品工业和饲料工业中获得了较好的效益.
以石榴树叶、石榴皮及石榴园土壤为分离源,共分离到71株酵母菌,经过三级筛选,获得两株适宜酿造石榴果酒的酵母菌,编号分别为SL18和SL20.发酵性能测试结果表明,SL20菌株在25℃时的发酵周期比对照菌株和SL18少1d,酒精度达到9.7%(V/V),并且所酿造的石榴酒香味浓郁纯正,而SL18在25℃时虽然发酵周期与对照菌株相同但所酿造的石榴酒香味比对照菌株要浓郁纯正.30℃时,3株菌起酵速度都比较快,SL20和SL18的发酵周期比对照菌株少1d,SL20菌株的酒精度高于SL18和对照菌株,为10.1%(V/V),但3株菌发酵的石榴酒香味没有20℃和25℃浓郁,说明自选菌株SL20和SL18适于25℃发酵并且所酿制的石榴酒明显优于常用的酿酒活性干酵母,并且两株菌能耐受12%(V/V)的酒精度,经鉴定均为酵母属(Saccharomyces)的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisive).
一种白酒快速老熟方法，步骤为：1)将待处理酒液储存于陶瓷或不锈钢储酒器中，把储酒器放置在阳光下接受日晒，每天在中午时晒2-3小时，连续4-8天；2)每天在日晒结束后将储酒器搬入到控温室储存，采用蒸汽对控温室进行升温，使控温室的温度在32-38℃，湿度控制在60-65％；加速酒的物理反应，促进酒的老熟；3)在日晒结束后，将储酒器放置在控温室中，并利用超声波振荡器对储酒器内的酒液进行定时或不定时的振荡，使酒液中分子之间产生运动，析出刺激性物质，利于香气成分的形成；使酒液处于一个持续运动状态，而且温度的阶段变化有利于有害成分的挥发以及香气成分的形成；4)在振荡结束后即可得到陈酿。
白酒的五大香型指浓香,清香,酱香,米香和其他香型,其中浓,清,酱,米四大香型为基本香型,相互独立,其他香型均由这四大香型派生而出,有兼香,药香,芝麻香,凤香,特香和豉香6个类别.其典型代表分别为浓香泸州老窖,五粮液,清香汾酒,酱香茅台,米香桂林三花,其他香型的兼香白云边,药香董酒,芝麻香景芝白干,凤香西凤,特香四特和豉香玉冰烧.其微量成分特征为:浓香型白酒以己酸乙酯为主,含量在160～250mg/100ml,占总酯40%以上;清香型白酒以乙酸乙酯为主体香,占总酯的50%以上,乙酸乙酯与乳酸乙酯的含量占总酯90%以上;酱香型白酒的主体香暂无定论,其糠醛含量较高,达260mg/100ml;米香型白酒以β-苯乙醇为特征成分,乳酸乙酯含量占总酯高达73%.其他香型白酒因门类不同,以数种成分为其特征.(一平)
β-防御素是机体的内源性抗菌肽.酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)甘露聚糖能够诱导绵羊(Ovis aries)瘤胃上皮细胞(ruminal epithelial cells,RECs)β-防御素-1 (sheepβ-defensin-1,SBD-1)的表达,但是诱导机制尚不明确,限制了甘露聚糖制剂的开发利用.为了探讨丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase,MAPK)信号传导通路(p38,ERK1/2,JNK)和核因子κB (nuclear factor κB,NF-κB)通路是否参与甘露聚糖诱导绵羊RECs SBD-1的表达,首先利用qPCR和Western blot方法检测甘露聚糖对p38、ERK1/2、JNK和NF-κB表达的影响;然后用甘露聚糖分别刺激RECs 5、15、30、45和60 min后,通过Western blot检测p38、ERK 1/2、JNK、IκB和p65的磷酸化水平;最后采用qPCR和ELISA方法检测p38、ERK1/2、JNK和NF-κB的特异性抑制剂对甘露聚糖诱导SBD-1表达的影响.结果 显示,甘露聚糖刺激使RECs中p38、ERK1/2、JNK和NF-KB的mRNA水平以及p38、JNK、ERK1/2、IκB和p65的磷酸化水平均显著提高(P＜0.01);同时,甘露聚糖刺激RECs不同时间可以使p38、ERK1/2、JNK、IκB和p65发生磷酸化;此外,p38、ERK1/2、JNK和NF-κβ的抑制剂均能极显著降低甘露聚糖诱导SBD-1的表达(P＜0.01),且p38抑制剂的抑制效果最明显.上述结果提示,酿酒酵母甘露聚糖诱导绵羊RECs SBD-1表达的过程可能由p38、ERK1/2、JNK和NF-κB信号通路共同调节,并且p38信号通路可能发挥更主要的作用.该研究探讨了甘露聚糖诱导防御素表达的机理,为解释甘露聚糖促免疫功能提供了新线索,也为更好地开发和利用甘露聚糖制剂提供了参考依据.
从拟康氏木霉3.3002基因组中克隆了内切葡聚糖酶EGI基因,该基因全长1566 bp,由3个外显子2个内含子组成,编码461个氨基酸.编码蛋白EGI的N端为22aa组成的信号肽,其后依次为催化结构域、连接肽和结合结构域.采用重叠PCR法获得无内含子的内切葡聚糖酶基因eg1,并将其成熟肽编码序列插入酿酒酵母分泌型表达载体pYEα中,构建成pYEα-Peg1重组质粒,转化酿酒酵母.重组转化子经β-半乳糖诱导,检测表达产物的分子大小以及酶活,结果表明,转化子在刚果红平板上可产生明显的水解圈；酶活检测显示该基因能在酿酒酵母中表达有生物活性的EG I并分泌到胞外；SDS-PAGE电泳显示EGI蛋白分子量比预期目的蛋白稍偏大.