利用定点突变改变树干毕赤酵母(Pichia stipitis)木糖醇脱氢酶辅酶特性的研究

在酿酒酵母中同时表达木糖还原酶基因(xyl1)和木糖醇脱氢酶基因(xyl2)可使酿酒酵母利用木糖发酵生成乙醇.但由于两种酶所依赖的辅酶不同导致酿酒酵母细胞内氧化还原失衡,致使中间产物大量积累,降低了乙醇产率.本研究从树干毕赤酵母中克隆了木糖醇脱氢酶基因,通过与银叶粉虱山梨醇脱氢酶[其活性依赖NADP+(H)]序列进行对比,确定突变位点,并利用融合PCR的方法进行定点突变.结果表明,突变体对辅酶NADP+(H)的亲和力有不同程度的提高,其中三点突变体的辅酶特性得到明显改变.本研究为构建高效利用木糖发酵生成乙醇的重组酿酒酵母奠定了基础.
在酒精-沼气双发酵耦联工艺中,将沼液和酒糟的混合水回用于酒精发酵过程,可有效解决传统酒精生产工艺存在的能耗大、废水处理成本高的问题.但是产业化应用中,该工艺会引起酒精发酵生酸较高.本文对造成这一问题的原因进行了研究,并探索了相应的解决方案.结果表明,沼液和酒糟混合、储存过程中,沼液中的产酸菌能够吸收利用酒糟中的营养物质快速生长并生成大量挥发性有机酸.产酸菌会对酿酒酵母产生竞争性抑制作用,而挥发性有机酸则会对酿酒酵母产生毒害作用.通过向沼液中加入适量的克菌灵可有效杀灭产酸菌,延缓混合水的酸化,从而消除对酒精发酵的影响.
本实验研究了酵母在红薯淀粉做辅料的麦汁中的发酵特性,并与其在大米做辅料的麦汁中的发酵特性作了对比,结果表明其完成主发酵所用的时间、可发酵浸出物的变化、还原糖含量的变化、α-氨基氮的利用情况、双乙酰的生成量等均无明显的区别,而且酵母的生长繁殖正常.红薯淀粉作辅料的啤酒色度较大.
将来源于嗜热细菌Thermus thermophilus HB8的木糖异构酶(Ⅺ)基因xylA与SPR1信号肽序列(ss)融合后连接到pRS424-TEFpr表达载体上,将重组质粒pRS424-TEFpr-ss-xylA转化酿酒酵母AN120野生型菌株、osw2△缺陷型菌株以及dit1△缺陷型菌株并进行产孢.通过荧光定位、蛋白免疫印迹分析以及酶活测定,表明酿酒酵母孢子“微胶囊”固定化酶系统构建成功.由于该固定化酶的最佳反应温度为85℃,避免了酿酒酵母孢子在D-葡萄糖为底物条件下萌发的弊端.同时,根据蛋白免疫印迹分析和重复利用性结果,表明二酪氨酸层的存在对于酶的包埋,对高温的耐受性都表现出了较好的特性.此外对野生型和osw2△孢子固定的Ⅺ的酶学性质进行了研究,相对于游离酶,孢子固定化酶更加稳定.在pH为6的酸性条件或pH为9的碱性条件下,固定化酶相对酶活能达到60％以上,同时在温度95℃时,固定化的酶相对酶活也能达到60％以上.与野生型孢子相比,osw2△孢子展现出了潜在的优势,既可以有效阻止酶的释放,又提高了底物分子的通透性.
为探究大球盖菇干燥前后风味成分轮廓数据及影响其良好风味的关键成分因子，对鲜品和4 种干制样品（热风干燥（hot-air drying，HAD）、真空冷冻干燥（vacuum freeze drying，VFD）、微波干燥（microwave drying，MWD）和自然干燥（natural drying，ND））中香气和滋味成分进行分析，共检出118 种香气化合物，经干制后香气丰富度提升显著（P＜0.05），VFD可大程度保留鲜品香气品质；提取19 个共有香气成分，作为大球盖菇特征成分轮廓，其中醛类化合物个数和含量优势明显，以正己醛（呈青草味）尤为突出。HAD较鲜品可溶性糖和游离氨基酸总量显著升高，VFD则呈味核苷酸损失最少，由此2 种干制方式等鲜浓度值（equivalent umami concentration，EUC）优势显著（P＜0.05）。风味感官综合评分VFD＞HAD＞ND＞鲜品＞MWD，基于评分和成分数据建立偏最小二乘回归模型，前3 个主成分R2X为79.4%，R2Y为98.9%，Q2为0.974，载荷信息显示2 种感官间交互影响明显；变量投影重要度分析显示，甜味氨基酸、1-辛烯-3-醇、丁基-2-辛烯醛和EUC，对大球盖菇良好特征风味呈现至关重要。本研究结果将为后续样品前处理方法筛选和风味相关产品开发提供理论依据。
本发明涉及一种糯米甜酒与白酒混合酒的制备方法，包括以下工艺步骤：第一步：选用糯米作主料经过高温蒸熟，加入甜酒药曲拌均匀，再加入25～35℃的水，置于容器内密封发酵，发酵温度控制在25～35℃，时间控制在24～36小时，有容器边见缝，且口感有甜味，即开封，在常温下保养3天以上，制成糯米甜酒中间体，其中各组份的投料重量比为：糯米100份，甜酒药曲0.6～1份，水60～100份；第二步、在糯米甜酒中间体中加入48～60°纯白酒，每100重量份糯米甜酒加入100～120重量份白酒，搅拌，置于密封容器内，经过二度发酵，发酵时间三个月以上，再经过滤，沉清，即可罐装制成混合酒成品。此酒酒质纯和香味丰满，色泽淡黄，口感和醇，略有甜味，营养丰富，经常饮用有健脾、胃、补肾活血之功能。