脂肪酸碳链延长酶与脱饱和酶在酿酒酵母中共表达

为了利用转基因技术在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中生产二十二碳六烯酸(DHA,22∶6A4,7,10,13,16,19n-3),构建了同时含C20-△5脂肪酸碳链延长酶(TFD5)和C22-△4脂肪酸碳链脱饱和酶(FAD4)基因的共表达质粒pYTFD5-FAD4.该质粒是通过基因重组的方法,使脂肪酸碳链延长酶与脱饱和酶基因置于各自启动子和终止子下获得的.共表达质粒pYTFD5-FAD4转化酿酒酵母所得到基因工程菌,在添加终质量分数为2%的半乳糖,终体积分数为1%的NP-40和0.3 mmol/L的底物二十碳五烯酸(EPA,20∶5△5,8,11,14,17n-3)下进行诱导,可直接转化二十碳五烯酸(EPA,20 ∶ 5△5,8,11,14,17n-3)生成二十二碳五烯酸(DPA,22 ∶ 5△4,7,10,13,16n-3)和二十二碳六烯酸(DHA,22 ∶ 6△4,7,10,13,16,19n-3).
[目的]探讨以南瓜为原料的发酵酒酿造工艺.[方法]通过单因素试验考察不同的酵母接种量、初始糖度、初始pH、主发酵温度对发酵南瓜酒乙醇含量的影响,再以乙醇含量、总糖度、澄清度、色泽、滋气味等因素的综合评分为依据,通过正交试验对酿造工艺进行优化.[结果]南瓜酒发酵的影响因素从主要到次要依次为酵母接种量、主发酵温度、初始pH、初始糖度；发酵的最佳条件是初始糖度20％、初始pH 3.5、主发酵温度21℃、酵母接种量6％,主发酵时间7d.主发酵液离心取上清液经10 d后发酵处理,得到成品南瓜酒.南瓜酒的相关理化指标为:乙醇含量11.0％-12.0％(V/V),糖度4～5g/L；得到的南瓜酒色泽呈浅橙黄色,酒中带有南瓜清香,甜酸协调适口,酒体透明、无沉淀.[结论]南瓜酒口感柔和,气味独具南瓜果味芬芳,是一种极具市场潜力的保健型果酒.
利用聚合酶链式反应(PCR)和多重PCR方法,采用3对特异性引物,检测40株酒酒球菌基因组中是否含有组氨酸脱羧酶基因(hdc基因)、酪氨酸脱羧酶基因(tdc基因)和鸟氨酸脱羧酶基因(odc基因).结果表明:40株酒酒球菌基因组中有33株酒酒球菌含有组氨酸脱羧酶,22株酒酒球菌含有酪氨酸脱羧酶,16菌株含有鸟氨酸脱羧酶.建立的PCR法可快捷、高度特异地检测酒酒球菌中含有的hdc基因、tdc基因和odc基因.
针对基于继电器控制J的海水流化冰制取设备的稳定性差、可移植性差、扩展能力弱等缺陷,提出了通过欧姆龙CP1E系列PLC控制海水流化冰制取设备,利用PLC系统编程简单、扩展容易、稳定性强、抗干扰能力强等特点,并结合海水流化冰制取设备的控制要求,设计了PLC控制系统的硬件接线图和软件梯形程序图,最终通过欧姆龙上位机控制和显示海水流化冰制取设备的工作状态.
对泰纳特、泰姆比罗和紫大夫3个酿酒葡萄品种果实可溶性固形物含量的变化及其与环境条件的关系进行研究.结果表明,3个品种果实自转色至成熟,可溶性固形物含量基本呈直线上升;成熟果实可溶性固形物含量分别为21.5%、19.5%和18.8%;降水明显影响了可溶性固形物含量的变化.提出果实进入转色期后浇水应视土壤墒情而定,采前2～3天不浇水,生理成熟期后及时采收,防止果实糖度降低,影响品质.
SpyTag/SpyCatcher环化技术是一种自发迅速的共价连接反应,通过环化蛋白的骨架以实现目标蛋白的环化,从而提高目标蛋白稳定性.研究显示,SpyTag/SpyCatcher技术介导的环化过程不受环境的影响,不会影响目标蛋白原本的催化活性和功能,且一旦完成便具有极强的稳定性.小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifiers,SUMOs)是一种十分有效的促溶标签,广泛应用于重组蛋白的原核表达过程中.泛素样特异蛋白酶1(ubiquitin-like-specific protease 1,Ulp1)是SUMO特异性蛋白酶中的一个重要成员,具有将SUMO从目标融合蛋白上切下,不残留任何氨基酸碱基的特异性酶切活性,且参与SUMO的成熟过程,但较差的稳定性限制了其应用.本研究使用截断型Ulp1(Gly304～Lys621)代替全长Ulp1,并对其序列进行了优化,得到了重组截断型Ulp1.重组截断型Ulp1既具有Ulp1全部的酶活性,又能更好地在大肠杆菌(Escherichia coli)中高效表达.本研究设计并表达了重组截断型(recombinant truncated Ulp1-His6,rtUlp1)、SpyTag-rtUlp1-SpyCatcher-His6(crtUlp1)和Spy-TagΔDA-rtUlp1-SpyCatcherΔEQ-His6(lrtUlp1)三种蛋白酶.综合比较3种蛋白酶的最适反应条件以及热稳定性,结果显示,crtUlp1的最佳反应酶切温度比lrtUlp1高10℃,比rtUlp1高5℃.crtUlp1在40℃条件下孵育2 h后仍保留87.3％的相对酶活,lrtUlp1在40℃条件下孵育2 h后仍保留43.69％的相对酶活,而rtUlp1几乎丧失了全部的酶活.且crtUlp1在广泛的酸碱范围内都能保持较高的酶活,而rtUlp1与lrtUlp1只在其最佳反应pH下表现出较高的酶切活性.本研究利用SpyTag/SpyCatcher技术获得了高稳定性的rtUlp1,评价了环化结构对rtUlp1热稳定性的影响以及SpyTag/SpyCatcher技术对rtUlp1热稳定性提高的效果,为获得具有高热稳定性的SUMOs特异性蛋白酶及促溶标签SUMOs的广泛使用提供技术基础.