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木糖还原酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的定向整合

来源:酒旗网  作者:酒小旗   2024-07-10 阅读:531
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是重要的乙醇生产菌株,但因缺少戊糖代谢途径而不能利用木糖,为了改良工业酿酒酵母利用半纤维素发酵生产乙醇的性能,利用分子生物学技术构建能够利用木糖的基因工程酵母。选取酿酒酵母染色体的rDNA重复序列作为外源基因整合位点,依此构建多拷贝染色体整合型载体pUG-LR。采用融合表达策略扩增得到含有酿酒酵母乙醇脱氢酶启动子PADH和树干毕赤酵母木糖还原酶基因xyl1的融合序列,并将其插入pUG-LR载体中,构建成含遗传霉素G418抗性标记的同源重组质粒pUG-LR-XYL1。以工业酿酒酵母ZU-01为宿主,通过优化后的电穿孔法将重组质粒导入经缓冲液处理的酵母细胞,30℃培养。通过提高YEPX复筛培养基G418浓度,得到10株生长较快的优良性状转化子。在不含G418的YEPX培养基上传代8次以上,以转化子基因组DNA为模板,进行PCR检测,均可获得目的基因片段。研究结果表明:木糖还原酶基因xyl1已定向整合于ZU-01染色体DNA上并稳定遗传,为后续构建工业酿酒酵母的木糖代谢通路、利用木糖产酒精的重组菌株奠定了基础。
绝缘子覆冰及其电气特性试验方法是严重覆冰地区外绝缘设计的重要基础,但至今尚无该试验方法的标准.在总结国内外现有试验方法的基础上,参照IEC507和IEEE Std 4等高压试验标准,提出了表征绝缘子覆冰的特征参数,探讨和分析了绝缘子覆冰及其电气性能的试验方法、试验程序以及对其试验电源的要求.结果表明,绝缘子覆冰分为人工覆冰和自然覆冰,人工覆冰常用不带电和带电覆冰,电气特性的主要试验方法有耐受法、平均闪络电压法和U形曲线法等,其中U形曲线法用于融冰期,耐受法、平均闪络电压法既可用于融冰期也可用于覆冰期,覆冰绝缘子的试验电源满足污秽绝缘子试验电源要求即可.
对发酵苦瓜酒的制作工艺进行了初步探讨.苦瓜汁中加入0.02‰的Na2SO3,苦瓜汁糖度调整为20~22°Bx,总酸度控制在3.4~3.6,接种干酵母为0.1‰,发酵温度控制在22~26℃,发酵7~10 d.前发酵结束后,进行后发酵,在18~20℃下维持半个月,当残糖降到3°Bx后,封坛转入陈酿.在陈酿期间,加入0.2‰的明胶,0.4‰的皂土,最终制得色泽淡黄、酒质清晰、清爽芳香,且酒味醇厚的发酵苦瓜酒.
在单因素实验的基础上,采用正交试验对培养基和培养条件优化,并结合微胶囊化培养方法,以实现酿酒酵母FM-S-115的高密度培养.结果 表明,单因素实验对碳源和碳源含量、氮源和氮源含量、温度、pH和菌液接种量七个条件的优化确定三个影响最显著的因素为:温度、pH和碳源含量.通过三因素三水平正交试验得出最适培养条件:温度是32℃,pH为4.5,碳源为蔗糖且含量为16%,在此条件下培养计得活菌总数为1.79×1o8 CFU/mL,是正常培养条件下1.02×1o8 CFU/mL的1.75倍.通过计算不同质量浓度海藻酸钠和氯化钙制得的微胶囊破囊率得出,海藻酸钠质量浓度为1.2%,氯化钙质量浓度为7%时,破囊率最低.将微囊化酵母在最适条件下静置培养四代,菌落总数为8.10×108 CFU/g,是正常培养的7.94倍,是在最适条件下摇床培养的4.53倍,菌体密度得到大幅提升.
[目的]探讨制备大豆小分子肽的最佳工艺条件.[方法]以脱脂大豆粉为原料,通过多种微生物菌种固态发酵产蛋白酶水解制备小分子肽,并应用正交试验优化制备条件.[结果]试验得出,微生物发酵法制备大豆小分子肽的最优发酵条件为:料液比1∶1.0 g/ml、0.2%黑曲霉、0.2%米曲霉、1‰酿酒酵母、发酵温度32℃,湿度80%、发酵时间36 h时,蛋白酶活力为466.8 U/g;最优水解条件为:水解温度55℃、水解时间10 h、pH 6.5、料液比为1∶2.5 g/ml时,水解度可达到90.61%.[结论]此工艺方法提高了脱脂大豆粉的食用价值和产品附加值.
采用反相高效液相色谱分析了梨酒、梨醋中有机酸,研究了发酵条件对其有机酸的影响.研究结果表明:酿酒酵母在酒精发酵过程中可代谢梨汁中有机酸.与梨汁相比,梨酒中的草酸、奎宁酸含量下降,乳酸、琥珀酸含量上升.梨酒中乙酸、琥珀酸随着酒精发酵温度的升高而增加,而苹果酸、乳酸、奎宁酸则随着酒精发酵温度的升高而降低.醋酸菌具有代谢各种有机酸的功能,在醋酸发酵过程中均消耗柠檬酸,而产生和积累酒石酸.梨醋中酒石酸、奎宁酸、莽草酸、琥珀酸和乳酸随着醋酸发酵温度的升高而增加,苹果酸和草酸几乎不受发酵温度的影响.发酵方式影响醋酸菌对有机酸的代谢.

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