CRISPR/Cas基因编辑技术及其在真菌中的应用

CRISPR/Cas系统是细菌和古生菌中抵抗外源病毒或质粒入侵的获得性免疫系统.其中II型CRISPR/Cas系统已被改造成为一个简便、高效的基因编辑工具,并在动物、植物和微生物基因功能研究和遗传改良中得到广泛应用.简述了CRISPR/Cas系统的结构、作用机理及分类情况,归纳总结了CRISPR/Cas9系统在酿酒酵母和其他丝状真菌中的应用,并对该技术可能出现的问题及应用前景进行了展望,以期为真菌基因编辑研究提供参考.
研究了浸入式固相微萃取检测(DI-SPME)中国白酒风味成分的方法。对DI-SPME使用的条件进行了优化。其最佳检测条件是:将白酒酒精度调整到14%vol,采用PDME萃取头,在搅拌状态下,先将样品于30℃预热15min,再插入萃取头萃取30min。然后进行样品的GC-MS分析。对一种中国白酒样品进行了定量分析,发现DI-SPME的方法特别适合于中国白酒微量成分的检测。检测结果表明,浓香型酒中酯的含量约占整个微量香味成分含量的91%。一次检测出52个微量香味成分。
以谷胱甘肽产生菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y-15为出发菌株,经"实践八号"育种卫星搭载后,以放线菌素D作筛选标记,获得一株抗性突变体HY-90,经摇瓶发酵,谷胱甘肽产量达到123.04 mg/L,是出发菌株的1.7倍,其胞内含量为14.86 mg/g,是出发菌株的1.5倍.此外,本试验还对谷胱甘肽乙醇抽提法作了优化.结果表明:将酵母干菌体按质量体积比1∶90∶10,用40%的乙醇和25%的偏磷酸进行抽提,可提高提取率.
本研究将酿酒酵母穿梭质粒pESC-Leu的诱导型启动子GAL1和GAL10分别替换为PGK1和TEF1启动子,构建了组成型双启动子表达载体pESCD,再将甜叶菊糖基转移酶UGT76G1的编码基因亚克隆到pESCD的Sal Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点之间,构建了组成型表达UGT76G1的重组质粒pESCD-UGT.将pESCD-UGT转化到酿酒酵母YPH499中进行表达,结果确定该重组酵母在SD-L液体培养基培养24h达到稳定期,菌体培养8h蛋白表达量高,选用1％的甲苯作为重组菌全细胞催化的通透剂时,催化15h产生288mg/L的莱鲍迪甙A,其产量是对照组的5倍.
列举了部分名优白酒的微量成分含量,并探讨了由这些微量成分构成的风味特征.指出主体香味成分的含量比例构成了各种香型白酒的不同风格.
一种石斛茅台镇酱香型白酒，涉及一种白酒，该白酒的组份及各组份的重量份为：石斛60份、麦冬50份、山萸肉60份、牡丹皮50份、龟板60份、鳖甲60份、女贞子60份、菟丝子50份、肉桂50份、当归40份、桑椹60份及茅台镇酱香型蒸馏白酒1500份，此酒具有滋阴清热、生津止渴的功效，对胃有虚热，津液不足，口中干渴，饮食不香者，有生津养胃，帮助消化之功；对老年人肝肾不足，两目昏花，视物模糊者，久服大有裨益，有补肾益肝明目之效。