黄曲霉寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在工业酿酒酵母CICC1346中的表达

通过重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension,SOE-PCR)扩增黄曲霉寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因和酿酒酵母α-信号肽序列,定向重组到整合型表达载体pδRCMB中,并在CICC1346中实现分泌表达;然后通过同源建模、利用分子模拟软件Discovery Studio 4.1分析其蛋白结构,以对硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷(pNPG)为底物,建立并确定酶活反应条件,并进行纯化、酶学性质分析;将密码子优化后序列在CICC1346中实现分泌表达,利用淀粉进行共发酵实验.结果显示:重组酶突变后相对野生型蛋白结构无影响.SDS-PAGE分析重组重组酶大小约为70 kDa;优化后最高酶活达到0.69 U/mL,重组酶最适pH为6.5,在pH4.5.0 ～ 7.0维持90％以上的酶活;最适温度为40℃,在30 ～ 40℃维持接近100％的酶活;受Cu2+和MR2+严格抑制;寡聚-1,6-葡萄糖苷酶与α-淀粉酶及糖化酶协同利用淀粉产乙醇,提高淀粉水解效率.这是首次报道黄曲霉的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因在酿酒酵母整合型分泌表达.
本试验以酿酒酵母和枯草芽孢杆菌作为混合菌种发酵小麦麸皮,通过Amberlite XAD-2柱分离纯化制备麦麸阿魏酰低聚糖(feruloyl oligosaccharides,FOs),探讨麦麸FOs对敌草快(diquat)诱导的大鼠氧化应激是否有缓解作用.试验选用体重相近的断奶雄性大鼠48只,随机分为未攻毒组、攻毒组、攻毒+100 mg/kg BW麦麸FOs组、攻毒+200 mg/kg BW麦麸FOs组、攻毒+300 mg/kg BW麦麸FOs组和攻毒+100 mg/kg BW维生素C组,每组8个重复,每个重复1只鼠,各组大鼠均饲喂相同的商业饲料.麦麸FOs和维生素C配制成水溶液,采用灌胃的方式给予,未攻毒组、攻毒组用生理盐水替代,灌胃体积0.2 mL,连续灌胃15 d.灌胃结束当天,未攻毒组大鼠注射0.3 mL生理盐水,其他5组按0.1 mmol/kg BW的剂量腹腔注射0.3 mL敌草快.敌草快攻毒12 h后取样,分析各组大鼠血浆以及肝脏、肾脏和回肠中总抗氧化能力(T-AOC),过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性以及谷胱甘肽(GSH)和8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的含量.结果显示:1)通过混菌发酵小麦麸皮制备麦麸FOs,利用Amberlite XAD-2柱进行分离纯化,获得的麦麸FOs浓度为0.059 mmol/g.2)腹腔注射敌草快显著降低大鼠血浆中SOD活性和GSH含量(P<0.05),显著降低大鼠肝脏中T-AOC,CAT、GSH-Px活性及GSH含量(P<0.05),显著降低大鼠肾脏中T-AOC及CAT、SOD活性(P<0.05),显著降低大鼠回肠中T-AOC,CAT、GSH-Px活性及GSH含量(P<0.05),并显著提高大鼠血浆和各组织中8-OHdG含量(P<0.05).3)在敌草快引起的氧化应激状态下,灌胃一定剂量的麦麸FOs可以显著提高大鼠血浆中SOD(400 mg/kg BW)、GSH-Px活性(100和200 mg/kg BW)以及GSH含量(100和200 mg/kg BW)(P<0.05),显著提高大鼠肝脏中T-AOC(100、200和400 mg/kg BW),CAT(200和400 mg/kg BW)、SOD(100、200和400 mg/kg BW)和GSH-Px活性(100、200和400 mg/kg BW)以及GSH含量(100、200和400 mg/kg BW)(P<0.05),显著提高大鼠肾脏中T-AOC(400 mg/kg BW),CAT(200 mg/kg BW)和GSH-Px活性(200和400 mg/kg BW)以及GSH含量(400 mg/kg BW)(P<0.05),显著提高大鼠回肠中T-AOC(200 mg/kg BW),SOD(400 mg/kg BW)和GSH-Px活性(100、200和400 mg/kg BW)以及GSH含量(100、200和400 mg/kg BW)(P<0.05),显著降低血浆和各组织中8-OHdG含量(血浆、肾脏、回肠:100、200和400 mg/kg BW;肝脏:100 mg/kg BW)(P<0.05);且灌胃200、400 mg/kg BW麦麸FOs后,大鼠血浆和组织中部分抗氧化相关指标可恢复到正常生理状态水平.综上所述,本试验制备的麦麸FOs可以通过有效提高大鼠血浆和组织中抗氧酶活性和GSH含量,降低DNA氧化应激代谢产物8-OHdG的含量,有效缓解由敌草快诱导产生的氧化应激.
建立了一种用毛细管气相色谱法测定白酒中甲醇,乙酸乙酯和杂醇油的方法,并对色谱条件进行了优化.样品加标回收率在91.7%-98.5%之,相关系数在0.9954以上,相对标准偏差1.1%～3.1%.该方法简便,快速,准确,结果令人满意.
随机扩增多态性DNA(RAPD)具有快速、简便和灵敏等优点,在酿酒酵母的分子鉴定和分类、菌种分离纯化和污染检验、探索种属间亲缘关系和进化过程以及基因定位和辅助育种等研究中具有广阔的应用前景.本文对RAPD在酿酒酵母研究中的应用进行了综述,并且着重探讨了在上述研究应用中的缺点及改进方法.
为实现冰鲜鸡肉和解冻鸡肉的快速鉴别,本实验采用离子迁移谱技术,取新鲜(对照组)、冰鲜和解冻鸡胸肉各10 g并搅碎成肉糜状,测定其剪切力、保水性(蒸煮损失率、汁液流失率、滴水损失率及加压损失率)、色泽和质构等理化指标并进行离子迁移谱的图谱采集,对其进行标准变量正态变换处理,利用主成分分析及判别函数分析进行鉴别.结果表明:冰鲜鸡肉的各项理化指标与新鲜鸡肉相比无显著性差异(P>0.05),而与解冻鸡肉相比差异显著(P<0.05);冰鲜鸡肉与解冻鸡肉的主成分分析得分达到98.60%,判别函数法得分高达99.17%,完全能够将2种样品进行区分.因此,离子迁移谱用于鉴别冰鲜鸡肉和解冻鸡肉是可行的.
为了确定冰氧吧纤维与粘胶纤维混合物各组分的含量,采用硫酸法对混合物进行定量试验研究;探讨了试样干重、硫酸溶液配置、试验方法等,并对试验数据进行分析,找出冰氧吧纤维与粘胶纤维的区分方法.指出:硫酸法可有效地对冰氧吧纤维与粘胶纤维混合物进行定量分析,并确定出各组分的含量;在40％硫酸溶液中,温度为100℃时,定量分析需对冰氧吧纤维含量进行修正,修正系数为1.01.