酿酒酵母中的嗜热细菌木糖异构酶活性表达及木糖代谢研究

将来自嗜热放线细菌Thermobifida fusca的木糖异构酶(xylose isomerase,XI)基因xylA,连接于酵母表达载体pYES2 的半乳糖诱导启动子(PGAL)下,得到重组质粒pYES2-xylA,用其转化酵母菌INVSc1,测定重组酵母菌株INVSc1-xylA的木糖异构酶活性,并对重组酵母菌株进行木糖葡萄糖共发酵试验,探讨在酿酒酵母中建立新的生产乙醇木糖代射途径.结果木糖异构酶在75℃,pH值6.8的酶活力最高,在酿酒酵母中成功地获得活性表达,并且SDS-PAGE 电泳有明显的特异性表达产物带,单体分子量为43kD.INVSc1-xylA在木糖葡萄糖共发酵实验中消耗木糖和产生乙醇分别比对照菌提高53.8%和36%,提高了其生产乙醇的能力.
[目的]研究酿酒酵母SOD和CAT对NaCl和Na2CO3胁迫的生理响应.[方法]采用分光光度法,测定不同浓度NaCl和Na2CO3胁迫条件下酵母菌SOD和CAT的活性指标；采用比浊法,测定不同浓度NaCl和Na2CO3胁迫对酵母铜/锌超氧化物歧化酶缺失菌株(sod1Δ)和过氧化物酶缺失菌株(ctt1Δ)生长的影响.[结果]随着NaCl和Na2CO3胁迫浓度的升高,酵母细胞内SOD和CAT活性呈现上升趋势；与野生型菌株相比,NaCl和Na2CO3胁迫对sod1A和ctt1Δ基因缺失菌株产生更加明显的生长抑制作用.[结论]SOD和CAT在酿酒酵母抵抗NaCl和Na2CO3胁迫中发挥重要作用.
将酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因GPDH1的编码序列构建到表达载体pPIC3.5K中,利用电转化法将构建好的表达载体转入巴斯德毕赤酵母中,利用含有G418的YPD平板筛选到两个阳性转化子,通过分子生物学及外源蛋白表达实验证明,酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因GPDH1已经整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上,并且得到了预期的表达.
以红佳酿酿酒酵母为出发菌株,通过离子交换法分离纯化β-葡萄糖苷酶,测定酶活力和蛋白质含量,并研究温度、pH值稳定性和金属离子、葡萄糖、酒精度对酶活力的影响.结果表明:粗酶液经过离子交换层析后,纯化倍数为19.41,得率为38.67％;经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)电泳检测为1条谱带,达到电泳纯,分子质量约为45 kD;β-葡萄糖苷酶热稳定性较差,在20～40℃较稳定,在pH 5.0～10.0较稳定;Al3+、Cu2+对酶活力有抑制作用,K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Na+对酶活力的影响不明显;葡萄糖和酒精对酶活力无明显抑制作用.
采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间-质谱法,研究2种酵母Red Fruit和Zymaflore ST分别在'北冰红'和'威代尔'冰酒的发酵过程中,对不同糖苷态香气物质含量的影响,以及瓶储1年后葡萄酒中糖苷态香气物质含量的变化.结果表明,'威代尔'冰酒中有更丰富的糖苷态香气物质种类和含量.酵母Red Fruit和Zymaflore ST发酵的'北冰红'冰酒中,戊糖基-葡萄糖苷类香气物质均略有下降,但酵母Zymaflore ST发酵对己糖基-葡萄糖苷类香气物质影响不显著.酵母Zymaflore ST发酵'威代尔'冰酒中,戊糖基-葡萄糖苷、己糖基-葡萄糖苷和葡萄糖苷类的香气物质均显著降低,而酵母Red Fruit对糖苷类型的香气物质均无显著影响(己糖基-葡萄糖苷类除外).瓶储1年后,'北冰红'冰酒中各种糖苷态香气物质含量均大幅降低.研究认为,酵母Red Fruit和Zymaflore ST对发酵过程中'北冰红'糖苷态香气释放影响很小,糖苷态香气释放可能主要在陈酿阶段,而酵母Zymaflore ST发酵较有利于'威代尔'糖苷态香气的释放.该结果为冰酒的酿造和陈酿工艺设计提供了参考.
试验对分离得到的霉菌进行淀粉酶和纤维素酶活性鉴定,获得了一株同时具有淀粉酶和纤维素酶活性的新霉菌.经形态学及分子生物学方法鉴定,初步认定其为一株未被报道过的米根霉,将其命名为Rhizopus oryzae TZY1.Rhizopus oryzae TZY1与保藏酿酒酵母进行餐厨垃圾共发酵,在没有外加任何酶类的条件下,发酵后大部分的淀粉及纤维素被利用,发酵乙醇产率与糖化发酵结果大致相等.发酵后经检测,淀粉的利用率在88％以上,纤维素的利用率在84％左右,较之同步糖化发酵,该方法可以部分避免由于酶失活而使乙醇产率降低的问题,并且不需外加糖化酶类,节约了成本,具有良好的产业化应用前景.