产甘油假丝酵母产甘油关键酶基因的克隆、测序及植物表达载体的构建

用PCR的方法,从产甘油假丝酵母 WL2002-5中扩增出了产甘油关键酶 3-磷酸甘油脱氢酶(glycerol 3-phosphate dehydrogenase)和3-磷酸甘油磷酸酶(glycerol 3-phosphate phosphatase)的基因GPD和GPP.对这两个基因测序,发现基与酿酒酵母(Saccharomyces.cerevisiae)的GPD、GPP基因的相似性达99%.并构建了其在植物中的表达载体.
本发明公开了一种浓香型白酒酿造工艺，所述的酿造工艺包括以下步骤：步骤一、选料；步骤二、原料酿造；步骤三、提高浓香型原酒绵爽度：辅料制备、浓香型甑桶底锅中串蒸。本发明的酿造工艺可大大提高酿造工艺的效率，降低制造成本，同时可以提高浓香型原酒绵爽度。
肉桂酸4-羟基化酶（Cinnamate 4-hydroxylase, C4H）是茶树苯丙烷代谢途径中的关键酶，能够影响木质素和类黄酮等次级代谢物的生物合成。本文采用5′-RACE 技术，克隆了茶树肉桂酸4-羟基化酶基因（CsC4H）的全长序列，其中开放阅读框长1518 bp，编码505个氨基酸，推测蛋白分子量为58.15 kD，理论等电点为9.29。利用基因组步移技术克隆得到该基因上游1840 bp的启动子序列。该启动子区域除了分布有TAAT-box和CAAT-box等基本转录元件外，还存在多个诱导型和组织特异型的顺式作用元件。实时荧光定量PCR结果表明该基因在芽、叶、茎、根中都有表达。将该基因重组至表达载体pYES-DEST52上，并在酿酒酵母 WAT11中进行真核表达。利用 LC-MS方法检测酶反应产物，结果表明目的蛋白能够催化肉桂酸生成p-香豆酸。
以As2399、grape Z2、Wine Z3三种酿酒酵母对樱桃果汁进行发酵酿造的樱桃酒为研究对象,利用高效液相色谱法对3种樱桃酒和樱桃果汁的酚酸类化合物、黄酮类化合物、有机酸类化合物进行分析比较.结果表明,所检测的各酚酸、黄酮、有机酸均呈现良好的线性关系(R2 ＞0.992),不同水平的添加回收率为91.93％ ～106.82％.4种样品分析表明,筛选的较优酿酒酵母是As2399.樱桃酒中总酚酸与总黄酮的含量均比樱桃果汁中减少.4种样品总酚含量依次为果汁＞ As2399＞ WineZ3＞ grapeZ2;总黄酮含量依次为果汁＞As2399＞ WineZ3＞ grapeZ2.樱桃酒中的绿原酸、咖啡酸、香草酸、p-香豆素和阿魏酸的含量均显著高于樱桃果汁,As2399樱桃酒中p-香豆素的含量显著高于另2种樱桃酒.樱桃酒与樱桃果汁中的芦丁、白藜芦醇、槲皮素、山奈酚含量无显著差异,在As2399樱桃酒检测到了黄芩素.3种樱桃酒中酒石酸、苹果酸、柠檬酸含量均比樱桃果汁中增加,草酸含量均比樱桃果汁减少;草酸、柠檬酸、富马酸在3种樱桃酒中无显著差异,As2399樱桃酒中酒石酸、柠檬酸与琥珀酸含量较另2种樱桃酒高.
金铁锁是国家二级保护珍稀濒危药用植物,三萜皂苷类化合物是其主要活性成分.目前,利用合成生物学构建酿酒酵母细胞工厂高效生产药用植物中有效化合物的研究已在逐步完善,为实现微生物发酵生产药用中药萜类有效成分提供了基础.掌握金铁锁有效成分三萜皂苷的生物合成途径,是进行金铁锁定向育种和利用合成生物学进一步开发人工细胞工厂发酵生产金铁锁总皂苷等活性成分的基础.该文利用合成生物学的方法 ,在酿酒酵母细胞中进行金铁锁三萜皂苷的生物合成途径异源重建,以解析金铁锁有效成分生物合成的途径.
研究蛋白质O-甘露糖转移酶(Protein O-mannosyltransferase,PMT)家族中PMT3基因缺失,以及PMT1与PMT3双基因缺失对酵母细胞复制性寿命的影响.采用一步基因置换法构建PMT3基因缺失酵母菌株(pmt3Δ),基于基因同源重组的原理,构建PMT1和PMT3双基因缺失酵母菌株(pmt1Δpmt3Δ);显微镜下分离和计数酵母子细胞的数目,统计酵母细胞复制性寿命.与野生型酵母细胞的平均复制性寿命(26代)比较,pmt3Δ 菌株(24代,P>0.05)和pmt1Δpmt3Δ 菌株(25代,P>0.05)的平均寿命均无明显变化,差异无统计学意义.酵母PMT3单基因缺失,以及PMT1和PMT3双基因缺失均不影响细胞的复制性寿命.