通过SpyTag/SpyCatcher介导的自发环化提高酿酒酵母S288C中Ulp1的稳定性

SpyTag/SpyCatcher环化技术是一种自发迅速的共价连接反应,通过环化蛋白的骨架以实现目标蛋白的环化,从而提高目标蛋白稳定性.研究显示,SpyTag/SpyCatcher技术介导的环化过程不受环境的影响,不会影响目标蛋白原本的催化活性和功能,且一旦完成便具有极强的稳定性.小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifiers,SUMOs)是一种十分有效的促溶标签,广泛应用于重组蛋白的原核表达过程中.泛素样特异蛋白酶1(ubiquitin-like-specific protease 1,Ulp1)是SUMO特异性蛋白酶中的一个重要成员,具有将SUMO从目标融合蛋白上切下,不残留任何氨基酸碱基的特异性酶切活性,且参与SUMO的成熟过程,但较差的稳定性限制了其应用.本研究使用截断型Ulp1(Gly304～Lys621)代替全长Ulp1,并对其序列进行了优化,得到了重组截断型Ulp1.重组截断型Ulp1既具有Ulp1全部的酶活性,又能更好地在大肠杆菌(Escherichia coli)中高效表达.本研究设计并表达了重组截断型(recombinant truncated Ulp1-His6,rtUlp1)、SpyTag-rtUlp1-SpyCatcher-His6(crtUlp1)和Spy-TagΔDA-rtUlp1-SpyCatcherΔEQ-His6(lrtUlp1)三种蛋白酶.综合比较3种蛋白酶的最适反应条件以及热稳定性,结果显示,crtUlp1的最佳反应酶切温度比lrtUlp1高10℃,比rtUlp1高5℃.crtUlp1在40℃条件下孵育2 h后仍保留87.3％的相对酶活,lrtUlp1在40℃条件下孵育2 h后仍保留43.69％的相对酶活,而rtUlp1几乎丧失了全部的酶活.且crtUlp1在广泛的酸碱范围内都能保持较高的酶活,而rtUlp1与lrtUlp1只在其最佳反应pH下表现出较高的酶切活性.本研究利用SpyTag/SpyCatcher技术获得了高稳定性的rtUlp1,评价了环化结构对rtUlp1热稳定性的影响以及SpyTag/SpyCatcher技术对rtUlp1热稳定性提高的效果,为获得具有高热稳定性的SUMOs特异性蛋白酶及促溶标签SUMOs的广泛使用提供技术基础.
对红兴隆农科所自育的六个二棱啤酒大麦品种进行比较试验，以探讨产量及其构成因素、品质性状等的演变规律，对二棱啤酒大麦的高产、优质育种目标等问题进行了讨论与展望。
以冷藏(4℃)的牛肉为对照,通过测定牛肉肌原纤维蛋白的ATP酶活性、巯基含量、溶解性、热稳定性和电泳等指标,研究冰温(-1℃)保鲜对牛肉蛋白结构和功能特性的影响.结果表明:随着贮藏时间的延长,牛肉肌原纤维蛋白的功能性显著降低.SDS-PAGE表明蛋白质发生不同程度的降解.在相同贮藏时间内,冰温保鲜比冷藏条件可减少蛋白质结构和功能性的变化.贮藏至第12天时,4 ℃冷藏牛肉肌原纤维蛋白的Ca2+-ATPase活性下降了72.9％,而冰温保鲜的牛肉下降46.9％;冷藏牛肉肌原纤维蛋白的总巯基和活性巯基含量分别下降50.12％和93.68％,而冰温保鲜牛肉降至35.08％和71.15％;冷藏牛肉蛋白质溶解度下降41.18％,而冰温保鲜牛肉下降15.52％.SDS-PAGE表明冷藏牛肉的肌原纤维蛋白降解程度比冰温保鲜的大,冷藏条件下的牛肉肌原纤维蛋白热稳定性亦不如冰温保鲜的高.冰温保鲜是一种有效牛肉保鲜方法.
为了探究菌粉、BS黏土复合硅酸钙材料对Cu2+的吸附特征及阻滞效果,分别将啤酒酵母菌粉和100% CEC的BS-12(十二烷基二甲基甜菜碱)修饰膨润土以质量比10%、25%和50%与硅酸钙(CK)组配,形成J-Ca(菌粉+硅酸钙)和BS-Ca(BS黏土+硅酸钙)两类复合材料.批处理法研究不同pH值和温度条件下复合材料对Cu2+的等温吸附特征,并采用运移模型验证两类复合材料对Cu2+的阻滞效应.结果表明,随着菌粉添加比例的增加,J-Ca材料对Cu2+的吸附能力逐渐降低,而BS-Ca材料对Cu2+的吸附量随BS黏土添加比例的增加而增大;相同菌粉和BS黏土添加比例下,复合吸附剂对Cu2+的吸附量表现为BS-Ca﹥CK﹥J-Ca.两类复合材料对Cu2+的吸附是一个自发、吸热(50%BS-Ca除外)和熵增的反应过程.10~30℃范围内,温度对CK和10%J-Ca吸附Cu2+的影响不大,而25%J-Ca和50%J-Ca对Cu2+的吸附量在不同温度处理下差异显著;当BS黏土添加比例达到50%时,BS-Ca吸附Cu2+的温度效应开始从增温正效应向增温负效应转变.随着溶液pH值的升高,两类材料对Cu2+的吸附量均有不同程度的增加.饱和水土柱运移试验中Cu2+穿透的体积数表现为25%J-Ca﹤CK﹤25%BS-Ca,出流浓度峰值表现为25%J-Ca﹥CK﹥25%BS-Ca;CK、25%J-Ca和25%BS-Ca对Cu2+的吸附率均达到了95%以上,且阻滞因子显示出25%BS-Ca﹥CK﹥25%J-Ca.
因柑橘中类黄酮化合物含量丰富,具有多种生理活性功能而被广泛应用于食品、药品、化妆品等行业.类黄酮主要从柑橘等植物中提取,少量通过化学合成或结构修饰.近年来,在大肠杆菌、酿酒酵母等宿主菌中构建代谢通路异源合成类黄酮的微生物方法已进入研究阶段,其具有安全性高,绿色环保,可持续发展的特点.本文简述了柑橘中类黄酮的合成代谢途径,微生物合成柚皮苷、橙皮苷、圣草次苷等类黄酮的研究进展及技术思路,对宿主菌代谢负荷大、基因表达效率偏低、碳通量流向不平衡等问题,提出优化宿主菌株选择、微生物共培养、表达体系优化及碳通量重定向等解决方案,以期对目前柑橘类黄酮的微生物合成研究提供参考.
目的:分离获得高耐受二氧化硫的枇杷酒苹果酸乳酸发酵(MLF)菌,为果酒生物降酸提供优良乳酸菌资源.方法:采用平板划线法,从自然发酵的枇杷酒中分离乳酸菌,并通过耐受性试验筛选优良的MLF乳酸菌;通过形态学特征、生态学特征、生理生化特征和16S rDNA序列同源性分析法对目标菌进行鉴定.结果及结论:R23和R35分别被鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum R23)和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei R35);R23与R35均具有MLF能力,且可耐受120mg/L的总SO2浓度,是2株优良的枇杷酒MLF菌.